ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34728—2017 无乳支原体PCR检测方法 PCR for Mycoplasma agalactiae 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34728—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准起草人：储岳峰、赵萍、高鹏程、陈胜利、贺英、逐忠新 1 GB/T 34728—2017 无乳支原体PCR检测方法 1范围 本标准规定了无乳支原体PCR检测方法的技术要求 本标准适用于检测羊（山羊和绵羊）临床样品和分离培养物中无乳支原体的核酸 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CA：接触传染性无乳症（ContagiousAgalactia） Maga：无乳支原体（Mycoplasmaagalactiae） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） TAE：核酸电泳缓冲液（Tris-Aceticacid-EDTA) CCU：颜色变化单位（Colorchangeunit） Taq 酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase) DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphates) bp：碱基对(BasePair) 4仪器器材 4.1仪器 高速冷冻离心机、PCR扩增仪、核酸电泳仪、水平电泳槽、恒温水浴锅、普通冰箱、低温冰箱（一70℃）、 凝胶成像系统、高压灭菌锅、组织匀浆设备。 2器材 4.2 微量加样器（0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100L1000μL）、0.22μm无菌滤 器、无菌棉拭子、灭菌采样容器。 5 试剂 5.12 2×PCR反应预混合液（含Taq酶、dNTPs和上样缓冲液）。 5.2DL2000DNA分子质量标准。 1 GB/T34728—2017 5.3电泳缓冲液（TAE）、1%琼脂糖、0.85%生理盐水、Maga培养基，配制方法见附录A。 5.46XPCR上样缓冲液。 5.5阴、阳性对照（制备方法见附录B）。 5.6商业合成的引I物，上游引I物（MAGAUVRC1-L）的序列为：5-CTCAAAAATACATCAACAAGC-3 下游引物（MAGAUVRC1-R）的序列为：5-CTTCAACTGATGCATCATAA-3。合成的引物用符合 6操作程序 6.1样品采集 6.1.1奶样 乳腺炎病羊无菌采集的新鲜奶样置于灭菌容器中（不少于1.5mL）。 6.1.2关节液 关节炎病羊无菌采集的关节液置于灭菌容器中（不少于1.5mL）。 6.1.3眼子 角膜结膜炎病羊用灭菌棉拭子在的眼结膜表面和眼角轻轻擦拭后置于灭菌容器中。 6.1.4组织 刚扑杀或死亡时间不超过24h病畜采集乳房病变部位组织及其附近淋巴结，置于灭菌容器中。 6.2样品的运输与储存 带的冰袋应没有完全融化。 6.2.2如样品不能被及时送到实验室，应置于一20℃冰箱中保存，保存期应不超过1个月；如需长期保 存样品，应置于一70℃冰箱。 6.3样品的处理 6.3.1奶样的处理 与生理盐水等体积混勾后，4℃、13000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀。 6.3.2关节液的处理 与生理盐水等体积混匀后，4℃、13000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀。 6.3.3眼拭子的处理 浸入1mL生理盐水中30min，充分捻动，挤干后弃去拭子，将浸出液在4℃、13000r/min离心 10min，弃上清，收集沉淀。 6.3.4组织样品的处理 剪成小块，按1g加人0.9mL生理盐水研磨后，在4℃3000r/min离心10min，弃沉淀。取上清 在4℃，13000r/min离心10min后，弃上清，收集沉淀。 2