ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7229—2019 鲤浮肿病诊断规程 Code of diagnosis for carp edema virus disease(CEVD) 行业标准信息服务平台 2019-11-01实施 2019-08-01发布 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7229—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起章。y IV 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：徐立蒲、余卫忠、张文、曹欢、王静波、王姝、潘勇、张锋、梁艳、王立新、李清。 行业标准信息服务平台 SC/T 7229—2019 鲤浮肿病诊断规程 1范围 本标准给出了鲤浮肿病的缩略语、试剂和材料、仪器和设备及临床症状，规定了采样、核酸检测及综合 判定。 本标准适用于鲤浮肿病的流行病学调查、诊断、监测和检 2 规范性引用文件 凡是不注日期的引用 最新版R GB/T 6682 析实 GB/T 18088 境动物检 SC/T7103 人 3缩略语 S 下列缩略语进 用王本 CEV:鲤 病c CEVD: 肿 U 4试剂和材料 4.1CEV阳性 质山 4.2水：符合 T668 4.3无水乙醇 机图 4.4荧光PCR 4.5套式PCR 0.商业试剂20%保存 4.6环介导等温折 友 存 4.7Bst酶：-20℃保存， 4.8引物：荧光PCR和鱼 PCR引物浓度 10 P引物浓 100umol/L.一20℃保存。 4.8. 1 荧光PCR引物 上游引物qF1:5'-AGTTTTOTAKATTGTAGCATTTCC 下游引物QR1:5'-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA -3 探针:5'-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1-3; 扩增CEVP4a蛋白基因中76bp的片段。 4.8.2套式PCR引物 上游引物F1:5'-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3'； 下游引物R1:5'-TGCAGGTTGCTCCTAATCCT-3'; 上游引物F2:5'-GCTGCTGCACTTTTAGGAGG-3’; 下游引物R2：5'-TGCAAGTTATTTCGATGCCA-3”。 4.8.2.2BF和BR扩增CEVP4a蛋白基因中的528bp片段.IF和IR从该片段中再扩增478bp片段。 上游引物BF:5'-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3'; SC/T7229—2019 下游引物BR:5'-CTCTTCACTATTGTGACTTTG-3'; 上游引物IF:5'-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3'； 下游引物IR：5'-TAGCAAAGTACTACCTCATCC-3。 4.8.3 LAMP引物 F3:TCCCACAGAATGTAATCTCAA; B3: ACCTCATCCAAATTACGTAGT; FIP: GTCTGTCTTCGATAAGACAATGACT-TGTGGAGTTTTTGAAGTATACTGT; BIP: TCAATCTGAATTCCTTTCCAGAACA-CGTTGATACAATTCCAGAGC; LF: TGCTCTAGTTCTAGGATTGT; 扩增CEVP4a蛋白基因片段。 5仪器和设备 5.1组织研磨器。 5.2高压灭菌锅。 5.3普通冰箱。 5.4超低温冰箱。 5.5低温离心机。 5.6生物安全柜。 5.7荧光PCR仪。 5.8PCR仪。 5.9可控温水浴锅。 6临床症状 发病鱼行动迟缓，有时呈昏睡症状。病鱼的症状包括：烂鳃、眼球凹陷、体表糜烂、出血、皮下组织水 肿、吻端和鳍的基部溃疡等。其中最常见的症状是包括烂鳃在内的鳃丝损害症状。鳃组织在低倍镜观察 显示上皮细胞的过度增殖导致鳃丝肿胀；高倍镜下表现出鳃细胞水肿、重度增生、鳃小片相互融合以及上 皮细胞脱落。参见附录A的A.6。 7采样 按SC/T7103的规定执行。取样数量按GB/T18088的规定执行。体长<4cm的鱼取整条；带卵黄 囊的鱼去掉卵黄囊；体长4cm～6cm的鱼苗取鳃及所有内脏；体长大于6cm的鱼则取鳃、肾。 8核酸检测 8.1DNA抽提 8.1.1将样品匀浆后按1：10比例添加PBS缓冲液或细胞培养液，冻融1次，1000r/min离心10min 后，取450μL上清液。加人到1.5mL的离心管中。 8.1.2加人450uLCTAB溶液（见附录B的B.1)混匀。25℃处理2h～2.5h。 8.1.3加人600uL抽提液1（见B.2），混合混匀至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约800 μL)置于新的1.5mL离心管中。 8.1.4加人700μL抽提液2（见B.3），充分混匀至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约600 μL)置于新的1.5mL离心管中。 8.1.5加人一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，一20℃沉淀核酸8h 以上。 2