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松材线虫检疫鉴定方法 Methods for quarantine and identification of Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle SN/T 1132—2002 前言 本标准的附录A、附录B为规范性附录,附录C、附录D均为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:沈培垠、徐培方、周弘、刁彩华。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规范了松材线虫检疫鉴定方法和依据。 本标准适用于口岸植物检疫过程中鉴定松材线虫。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2. 1 松材线虫pinewoodnematode,PwN 一种线形动物,隶属于动物界、线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目 (Tylenchida)、滑刃科(Apelenchoidoidea)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。能引起松树菱病,是针叶 树木上最重要的病原生物之一 2. 2 松材线虫为扩散和度过不良生存环境,在寄主组织中出现的一种特定类型的3龄幼虫。 息服务平 2. 3 松材线虫为扩散传播,适应不良环境,在媒介天牛和寄主组织中出现的一种特定类型的4龄幼虫。 2. 4 繁殖型3、4龄幼虫 propagative larva 3andpropagative larva4,LgL4 松材线虫正常生长和繁殖期出现的幼虫虫态。 2. 5 雌虫早期youngfemale 4龄幼虫刚完成蜕皮阶段而出现的早期松材线虫雌虫,具体表现为生殖系统发育尚未完全。 3检疫原理 松材线虫分布在被感染寄主的树体组织中,利用其在水中的活动性和密度大于水的特性,可以将寄 主组织破碎后浸泡在水中,使松材线虫从寄主组织中游离到水中,从而分离和获得松材线虫。 利用甘油置换松材线虫体内的水,可以使松材线虫标本能保存较长时间,从而方便对标本进一步鉴 定。 依据松材线虫成虫头部、食道的形态特征、雌虫的阴门、尾端和雄虫交合刺、交合伞形状等稳定遗 传的形态特征以及体长、体长/体宽比值等测计值,鉴定松材线虫。 4仪器及用具 4.1木工锯或电锯木工钻; 4.2样品袋; 4.3贝尔曼漏斗; 4.4浅盘(筛盘、底盘); 4.5改进型漏斗分离器; 4.6标准套筛(40目、400目、500目); 4.7显微镜(放大倍率40×~1000×,具目镜测微尺、绘图仪等); 4.8体视显微镜(放大倍率10X80×,具透射光源); 行业标准信息服务平台 4.9超净工作台; 4.10恒温培养箱; 4.11恒温烘箱; 4.12钟面(7cm,β9cm); 4.13培养皿l(7cm,p9cm); 4.14酒精灯; 4.15盖玻片; 4.16载玻片; 4.17线虫挑针; 4.18控温电热平板。 5药品和材料 5.1指甲油 5.20.1%硫酸链霉素(配方见附录A中A.6); 5.3TAF双倍液(配方见附录A中A.1) 5.4棉蓝-乳酚油(配方见附录A中A.2); 5.5福尔马林甘油液(配方见附录A中A.3); 5.6封片蜡(配方见附录A中A.4); 5.7PDA培养基(配方见附录A中A.5); 5.8灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。 6现场检疫 6.1直观检验 对应施检疫物观察材质是否干燥,木质部有否蓝变,有无媒介昆虫栖居的痕迹,如侵入孔、蛀道、 蛹室等。 6.2抽样和取样 6.2.1选取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品,若无上述特征时 可随机抽样。抽样数量为每批总件数的0.5%~5%,最低不得少于三件,不满三件时全部抽取。 6.2.2将所抽的样木锯成5cm左右的木段,或用木工钻多点钻取木屑(不得少于10g/份),标号后即送 样至实验室检验。 6.2.3取样时注意选取靠近虫道、蛹室的部位,钻取木屑时要注意先把取样部位的树皮剥净。 6.2.4必要时可将样木整件带回实验室检验。 行业标准信息 7实验室检验 7.1松材线虫的分离 松材线虫分离方法见附录B。 7.2线虫的镜检 在体视显微镜下观察钟面血中收集的线虫分离液,发现线虫后用挑针挑取或用50gL微量移液器吸取 服务 线虫并制成临时水玻片,在显微镜下观察。 7.2.1临时水玻片的制作 在载玻片上滴加一小滴水液(约50μL),将线虫挑至水滴中央,沉底。从水滴正上方加盖玻片,在酒 精灯上用1s的振幅周期通过10次左右,使线虫恰好被杀死。 7.2.2每份样品的分离液中线虫含量在20条以下的,全部制成临时水玻片境检;20条以上时,通过解剖 镜观察选取各类各虫态线虫制片镜检,每类每虫态线虫至少镜检三条以上。 7.3松材线虫的培养
SN-T 1132-2002 松材线虫检疫鉴定方法
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